Dag 4


Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

Fig1. Elektrofores av klyvd plasmid.

Fig1 är en bild på gelelektrofores av det klyvda materialet. Brunn 1 (Br 1) innehåller två fragment, det mindre är LL37 inserten som har klippts ut med restriktionsenzym EcoR1 och den strörre fragmenten är resten av plasmiden med linjär (dubbel nick) struktur. Br2 innehåller hela plasmider där dem med supercoiledstruktur syns tydligast. Br3 har samma inehåll som Br1 men är utspädd 100 ggr, där ser vi att det har skett en översvämning från markören bredvid och det går inte att se plasmidfragment. Det har skett en del smearing i markörerna, detta beror troligen på att vi hade för bråttom med vårt gel, den har inte fått härda tillräckligt länge.

Fig2. Nylon membran. Spegelvänt jämfört med Fig1.

Bruna färgen kommer från en reaktion med antikropparna som är bundna till prober. Proberna har gjorts komplementära med LL37 sekvensen genom random priming och det som har varit ospecifikt bundet har sköljts bort, därför kan vi dra slutsatsen att där det är brunt på membranet finns LL37 genen. Man kan se att denna typ detektion är mycket känsligare än elektrofores eftersom vi kan se närvaron av LL37 från brunnen med 100 ggr spädd lösning (Br 3) vilket inte är möjligt i Fig 1. Det går även tydligare att se oklyvt plasmid med andra strukturer än supercoiled (Br2).

En fördel med southern blotting jämfört med PCR är att den är mycket känsligare och kan detektera mycket små mängder, men den tar längre tid att utföra. En annan nackdel med southern jämfört med PCR är att den innehåller flera steg och det är inte bra, ju fler steg en metod har desto fler chanser finns det för laboranten att göra fel.

Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?

Det viktigaste är att man kommer till laborationen väl förberedd. Att man har läst på och förstår teorin bakom alla stegen, följer protokollet noggrant och inte har för bråttom. 

DAG 2: PCR-reaktion + kontrollelektrofores av PCR och plasmidprep

Idag har du utfört en PCR.

Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

Fig1. Kontrollelektrofores. Brunnarna från vänster till höger: Hel plasmid, PCR, Neg., Pos., Markör III, Markör IX. Klicka på bilden för att förstora.

Resultatet blev bra. Vi har kunnat bekräfta att PCR:en har fungerat och att vi hade inserten LL37 i vår plasmid. Om man tittar på andra brunnen från vänster (Fig1) ser man ett svagt band som är ca 560-600 baser lång, samma storlek som den i positiva kontrollen där vi vet att LL37 finns, och det fanns inte heller något band i negativa kontrollen, alltså har det inte skett en carry-over kontamination och vi kan lita på vårt resultat.

Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?

Vårt resultat blev lyckat men det fanns ett systematiskt fel som drabbade alla laboranter i vår grupp (Gr1), TAE-bufferten som användes vid elektroforesen var för surt (ca pH 4) vilket ledde till att färgen som användes i elektroforesen förlorade sin förmåga att binda till DNA efter en längre tids exponering till sur miljö. Vi hann avbryta elektroforesen innan detta kunde hända.

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Nej, allting var glasklart.

DAG 1

Syftet med dagens laboration är att rena plasmid DNA från E.Coli samt att göra en koncentrations och renhetsbestämming.

Reningen gjordes enligt Qiagen metoden, där man först utsatte dem transformanta cellerna för buffertlösning P1, som är en tris-buffert med RNase vars syfte är att degradera RNA molekyler. Sedan tillsätts buffert P2 som innehåller NaOH och SDS. NaOH gör lösningen basisk vilket denaturerar DNA, SDS:et förstör cellmembranet genom att ta bort lipider från membranet. Sist tillsätts N3 buffert som neutraliserar lösningen så att DNA:t kan återligera. Kromosomalt DNA kommer inte återligera korrekt och den nya strukturen det får kommer göra det möjligt att separera det genom centrifugering, även membranfragment kommer att separeras i centrifugen.

Koncentrationsbestämningen gjordes genom att spektrofotometriskt undersöka absorbansen, i plasmidlösningen, vid våglängd 260 nm. Det var känt att vid 1 A260 är konc. ca 50 mikro.g DNA/mL, med denna information kunde vi räkna ut konc. till 0,31 mikro.g/mikroL (0,062 A260) i vår plasmidlösning.

Dem uppmätta absorbanserna, vid 260 nm och 280 nm, kan också användas för renhetsbestämning. Det är känt att i rena plasmidlösningar är kvoten A260/A280 ca 1,8. Om kvoten är lägre än 1,8 kan bero på att det fanns proteiner kvar i lösningen. Proteiner har en absorbanstopp vid ca 280 nm, därför kan förekomsten av proteiner leda till att den uppmätta absorbansen vid 280 nm blir något förhöjt vilket i sin tur leder till en lägre kvot. Våra absorbansvärden var: 0,062 A260 och 0,040 A280 vilket ger en kvot på 1,55.

Fig. 1: Foto på absorbanskurva

Frågor att fundera över

Idag har du renat en rekombinant plasmid från en bakteriesuspension.

Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

RNA, membrandelar, proteiner, kromosomalt DNA

Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?

Vi fick tyvärr inte helt rent plasmid. Det fanns tydligen proteiner kvar i vår lösning eftersom vår A260/A280 kvot blev 1,55

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Hur gör man för att rena bort proteinerna?