Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.
Fig1. Elektrofores av klyvd plasmid.
Fig1 är en bild på gelelektrofores av det klyvda materialet. Brunn 1 (Br 1) innehåller två fragment, det mindre är LL37 inserten som har klippts ut med restriktionsenzym EcoR1 och den strörre fragmenten är resten av plasmiden med linjär (dubbel nick) struktur. Br2 innehåller hela plasmider där dem med supercoiledstruktur syns tydligast. Br3 har samma inehåll som Br1 men är utspädd 100 ggr, där ser vi att det har skett en översvämning från markören bredvid och det går inte att se plasmidfragment. Det har skett en del smearing i markörerna, detta beror troligen på att vi hade för bråttom med vårt gel, den har inte fått härda tillräckligt länge.
Fig2. Nylon membran. Spegelvänt jämfört med Fig1.
Bruna färgen kommer från en reaktion med antikropparna som är bundna till prober. Proberna har gjorts komplementära med LL37 sekvensen genom random priming och det som har varit ospecifikt bundet har sköljts bort, därför kan vi dra slutsatsen att där det är brunt på membranet finns LL37 genen. Man kan se att denna typ detektion är mycket känsligare än elektrofores eftersom vi kan se närvaron av LL37 från brunnen med 100 ggr spädd lösning (Br 3) vilket inte är möjligt i Fig 1. Det går även tydligare att se oklyvt plasmid med andra strukturer än supercoiled (Br2).
En fördel med southern blotting jämfört med PCR är att den är mycket känsligare och kan detektera mycket små mängder, men den tar längre tid att utföra. En annan nackdel med southern jämfört med PCR är att den innehåller flera steg och det är inte bra, ju fler steg en metod har desto fler chanser finns det för laboranten att göra fel.
Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?
Det viktigaste är att man kommer till laborationen väl förberedd. Att man har läst på och förstår teorin bakom alla stegen, följer protokollet noggrant och inte har för bråttom.
Hej Emre!
SvaraRaderaNi fick jätte bra resultat. Jag har en fråga, varför markörerna syns på elektroforesen men inte på membranet?
Hälsningar
Diana
Hej, Diana. Det är för att proberna är gjorda så att dem bara binder med LL37 sekvensen. Proberna får antikroppar bundna till sig och vid sista steget när man tillsätter detektionslösningen sker det en färgreaktion med antikropparna. Därför blir det bara brunt där LL37 genen finns och inte i markörerna som saknar denna sekvens. /Emre
RaderaDu har skrivit en bra blogg med bra kommentarer till resultaten.
SvaraRaderaDu undrar hur man blir av med proteiner vid dag 1. I detta fall skulle det enklaste vara att göra om preparationen och vara ännu mer noggrann. Om man inte har möjlighet till det kan man rena bort proteiner med en fenolextraktion om man tror att proteinerna kommer att störa kommande experiment.
Du jämför känslighet mellan metoderna. Det är riktigt att southern är känsligar än färgning med gelred, men här ser man inte riktigt samma sak. Med gelred så färgar du allt DNA, inte specifikt LL37.
De metoderna som är mest relevant att jämföra är PCR och Southern, och då är PCR mer känsligt eftersom du här amplifierar målsekvensen innan detektion.
Era resultat kanske inte visar det på ett tydligt sätt men om båda metoderna fungerat optimalt så skulle det synas tydligt att detektion av 50ng plasmid ger en betydligt starkare signal med PCR än med probe.
Bra och nyttiga lärdomar du tycker du fått efter denna labb:)
Annica