DAG 1

Syftet med dagens laboration är att rena plasmid DNA från E.Coli samt att göra en koncentrations och renhetsbestämming.

Reningen gjordes enligt Qiagen metoden, där man först utsatte dem transformanta cellerna för buffertlösning P1, som är en tris-buffert med RNase vars syfte är att degradera RNA molekyler. Sedan tillsätts buffert P2 som innehåller NaOH och SDS. NaOH gör lösningen basisk vilket denaturerar DNA, SDS:et förstör cellmembranet genom att ta bort lipider från membranet. Sist tillsätts N3 buffert som neutraliserar lösningen så att DNA:t kan återligera. Kromosomalt DNA kommer inte återligera korrekt och den nya strukturen det får kommer göra det möjligt att separera det genom centrifugering, även membranfragment kommer att separeras i centrifugen.

Koncentrationsbestämningen gjordes genom att spektrofotometriskt undersöka absorbansen, i plasmidlösningen, vid våglängd 260 nm. Det var känt att vid 1 A260 är konc. ca 50 mikro.g DNA/mL, med denna information kunde vi räkna ut konc. till 0,31 mikro.g/mikroL (0,062 A260) i vår plasmidlösning.

Dem uppmätta absorbanserna, vid 260 nm och 280 nm, kan också användas för renhetsbestämning. Det är känt att i rena plasmidlösningar är kvoten A260/A280 ca 1,8. Om kvoten är lägre än 1,8 kan bero på att det fanns proteiner kvar i lösningen. Proteiner har en absorbanstopp vid ca 280 nm, därför kan förekomsten av proteiner leda till att den uppmätta absorbansen vid 280 nm blir något förhöjt vilket i sin tur leder till en lägre kvot. Våra absorbansvärden var: 0,062 A260 och 0,040 A280 vilket ger en kvot på 1,55.

Fig. 1: Foto på absorbanskurva

Frågor att fundera över

Idag har du renat en rekombinant plasmid från en bakteriesuspension.

Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

RNA, membrandelar, proteiner, kromosomalt DNA

Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?

Vi fick tyvärr inte helt rent plasmid. Det fanns tydligen proteiner kvar i vår lösning eftersom vår A260/A280 kvot blev 1,55

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Hur gör man för att rena bort proteinerna?